利来电游

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                科技服务 > 表观遗传学研究服◥务 > m6A RNA甲基化测序

                m6A RNA甲基化测序

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                m6A RNA甲基化测序
                     RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上,而N6-甲基腺∩嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍∑ 的修饰。目前发现microRNA,circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中★的腺嘌呤上,其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定。“编码器(Writer)”即甲基■转移酶,目前已知这个复合物的成分ζ有METTL3,METTL14, WTAP和KIAA1429;而ALKBH5和FTO作为去甲基酶(消码器)可逆〖转甲基化;m6A由m6A结合蛋白识别,目前发现m6A结合蛋白(读码器)有YTH结构特朗普称美国新冠疫情可能正“触顶” 再提重启经济域蛋白ζ (包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3, YTHDC1和YTHDC2)和核不均一蛋白HNRNP家族(HNRNPA2B1和 HNRNPC)。在基因表达、蛋白翻Ψ译和RNA剪切等正常生物过程中具有重○要作用。近来有研究显示m6A RNA甲基化在乳腺癌、恶性血【液病、胶质母细胞瘤、宫颈癌等多种癌症的发生发展中具有重「要作用。


                 
                       图 1 m6A修饰◤的酶系统               图 2 m6A生物学功能


                一、MeRIP-seq实验流程

                图3 利来电游 m6A RNA甲基化测序实验流程

                二、m6A甲基▆化测序分析内容

                u  测序数据质量评估及QC

                u  测序序列与参考基因组比对

                u  RNA甲基化peak calling                  

                u  peak在基因组中的分布╲及注释

                u  Peak在基因组中富集程度ㄨ统计   

                u  差异RNA甲基化区域分析

                u  差异RNA甲基化区域GO与KEGG富集分析 



                三、研究案例

                1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
                    DNA甲基化异常是胶质瘤的表ω 观遗传调控因子,但RNA甲基化在肿瘤包括恶性胶质瘤(GBM)中的调控还尚未清楚。为研究m6A调节可◆能导致GBM患者临床◎疗效不佳,作者通过TCGA数据库,发现ALKBH5在恶性胶质瘤样干细胞(GSCs)中高表达且12岁智障少女遭性侵8个月2次怀孕 官方:尽早破案与GBM 病人¤不良预后相关,干扰ALKBH5  降低GSCs细胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖,进一步体内验证敲除卐ALKBH5可抑制肿瘤生长。
                    为研究ALKBH5的m6A作用机制,作々者利用芯片和m6A-seq筛选到胶质瘤增殖相关的FOXM1,最后通过qPCR、WB、免疫荧光、核质分离WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5通过去甲基化◥调节FOXM1在GSCs中的表达。
                    为研究ALKBH5对FOXM1的作用是否受其他因子的调节,作者研△究了FOXM1的邻近基因,发现lncRNA FOXM1-AS与FOXM1序列互补,且共表达、共定位,进一步通过RIP, RNA pull down等实验证明lncRNA FOXM1-AS促进ALKBH5 和FOXM1初级转录←本的相互作用。最后通过细胞实验进一步验证ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下维持FOXM1的表达和细胞增殖】,从而维持GSCs的干性。





                图4 ALKBH5敲除细胞财政部部长刘昆:将适当提高财政赤字率,发行特别国债中m6A修饰的特征和基因表达的变化
                2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progressionthrough YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)

                表观遗传改变极大地促进了人类癌症的发生。传统的表观遗传研究主要集中↓在DNA甲基化,组蛋白修饰和染色质重构。最近,RNA各种可逆的化学修饰被认为是一种新的表观遗传〗调控方式。m6A是真台湾地区银行机构人民币存款余额为2610.33亿元核生物mRNA最常见的化学修饰,在调控mRNA稳定性,剪切和翻译方面具有重要的作用。
                    作者使用转录组★测序发现了METTL3(甲基转移酶3),一种主要的RNA N6-腺苷-甲基转移酶,在人肝细胞癌(HCC)和多种实体肿瘤中显著高表达。在临床上,METTL3的过度表达与肝细胞癌患者不良预后有关。体外≡实验证明敲除METTL3会显著外围股市集体上涨 全球股市为何突然飙升?抑制HCC细胞增殖,迁移及克隆形成。体内实验证明敲♂除METTL3会明显希腊累计确诊新冠肺炎病例46例抑制HCC体内成瘤和肺转移。另外,使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系统,内源性高表达METTL3会显著促▂进HCC细胞在体外和体内生长。通过转@录组测序、m6A-Seq、MeRIP-PCR,作者确定了SOCS2(细胞因子信前10月国企利润总额29394亿元 同比增长5.4%号2的抑制因●子)作为METTL3介导的m6A修饰的下游靶基因。 敲除METTL3表@ 达会消除SOCS2 mRNA m6A修饰并增强SOCS2 mRNA表达。m6A介导的SOCS2 mRNA降♀解是依赖于m6A“读取器”蛋白YTHDF2。总之,METTL3在HCC大部分高人社部门将与多家银行开展就业补贴等资金入卡服务表达中,并通过m6A-YTHDF2依赖机制抑制SOCS2表达从而□促进HCC进展。因此,作者发现了在肝肿瘤发生︻过程中表观遗传改变的一种新机制。


                图5 RNA甲基化转移酶METLLT3在肝癌组织中〇高表达
                (转录组测序结果及TCGA数据库分析)

                3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
                     在许多№不同种类的RNA中,都已观察※到N6 -腺苷(m6A)的甲基化,但其在microRNAs中还没有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3细胞系中,通过敲除m6A甲基转移酶FTO筛选到表达差异的▲microRNA,说明miRNA受m6A甲基化的调因同机有乘客阳性 入境者抵京隔离8天后检测确诊控。进一步通过MeRIP-Seq发现相当一部分』的microRNA具有m6A修饰。通过motif分析,他们发现了区分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。该文章所述的表观遗传修饰在基因表达的转录后调控的复杂性上增加了一个新的层次。


                图7 FTO敲除对甲基化的miRNAs的稳定∮状态的影响。


                四、送样要求

                A样品要求:

                1. 样品类型:细胞、新鲜组︼织或RNA样品。

                2. 样品量:细胞样品〓请提供至少5×107~108个细胞,组织样品请提供至少5g的组织块,RNA样品请提供500μg以上的总RNA。

                3. 样品质量:RNA无明显降解英国脱欧法案“临门一脚遇铁板”,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度 ≥ 500ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥7。

                4. 样品保存:细胞样品或新鲜组织◥块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品◢可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复↑冻融。

                5. 样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。



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